محلول فایکول 100 سی سی

روش استفاده از محلول فایکول برای جداسازی سلول ها خون
1-رقیق سازی خون :
ابتدا حجم 5 میلی لیتر خون EDTA شده از هر نمونه را در فالكون 15میلی لیتری را با نسبت یک به یک (50%-50%) با 5 میلی لیتر PBS یا بافر مورد استفاده برای دریافت غلظت مناسب رقیق می کنیم . در صورتی خون به صورت فرش باشد و مقدار غلظت (RBC( خون بالا نباشد میتوانید از خون غلیظ مستقیم استفاده کنید.
2-مقدار فایکول: مقدار 5 میلی لیتر محلول فایكول را در لوله فالکون مشابه دیگری ریخته و سپس بوسیله پیپت پاستور خون رقیق شده در مرحله
قبل را به آهستگی و به شکلی که با محلول فایكول مخلوط نشود از کنار دیواره و به آرامی روی سطح فایكول می ریزیم. نباید خون رقیق شده با محلول فایكول تركیب شود و می بایست خون روی سطح فایكول قرار گیرد
3-مرحله سانترفیوژ: سپس لوله فالكون رادرسانتریفیوژیخچالدارقرارداده بادمای20تا18درجهسانتیگرادودورrpm 4000(،g400)
برای 9 الی 10 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم تا لایه های مختلف براساس شیب چگالی جدا شوند. اگر از سانترفیوژ یخچال دار استفاده میکنید برای بهتر استخراج شدن سلول با کیفیت 9:Break :0 ،Acceleration را تنظیم کنید.
4-برداشت سلول:
پس از انجام سانتریفیوژ فالكون حاوی لایه های متمایز به ترتیب از بالا به پایین شامل : پلاسما (زردرنگ) Buffy Coatحلقه شیری رنگ کدر)، فایكول ( شفاف) و گلبولهای قرمز (قرمز تیره )می باشد. بوسیله پیپت پلاستیکی یا سمپلر و با دقت کامل، حلقه شیری رنگ و کدر بین سرم و فایكول را جدا کرده و به لوله ای دیگر منتقل می کنیم. > حلقه شیری رنگ کدر Buffy Coat حاوی سول های PBMC می باشد.
5- به نمونه Buffy Coat جدا شده تا حجم 10 میلي لیترPBS ، یا بافر مورد استفاده رواضافه می کنیم
6- فالكون حاوی Buffy Coat و PBSرا در دمای 4 تا 6 درجه سانتیگراد برای مدت 5 دقیقه و با دور 2500 rpm در سانتریفیوژ
یخچال دار سانتریفیوژ می کنیم
7مرحله شستشو: مرحله شستشوی فوق را بار دیگر تکرار می كنیم.
8- سلولهای ته نشین شده را جداسازی کرده و برای انجام مراحل بعد به میکروتیوب های1الی 5میلی لیتری منتقل مي نماییم.